关键词：大型真菌；野外采集；显微观察；分子生物学研究
中图分类号：Q34文献标识码：A文章编号：16749944（2016）18017606
1引言
真菌是一个古老的生物类群，4亿多年前泥盆纪时期的化石中就发现有真菌。大型真菌是菌物中的一个重要类群，指菌物中子实体大型的一类真菌，泛指广义上的Mushroom 。
自16世纪以来，各国科学家就广泛开展了对大型真菌的研究。1735年，在林奈建立的两界分类系统（动物界和植物界）中，把真菌列入植物界；1860年Hogg和1866年Haeckel在先后建立的三界分类系统（原生生物界、动物界和植物界）中，把真菌列入原生生物界；在Copeland（1938）建立的四界分类系统（菌界、原生生物界、动物界和植物界）中，把真菌列入原生生物界；在1969 在Wittaker建立的五界分类系统（原核生物界、原生生物界、植物界、真菌界和动物界）中，才把真菌单独作为一界处理。1851～1950年间是近代真菌学全面发展的时期，20世纪50年代以来，现代真菌学飞速发展，有关真菌的研究著作层出不穷。据估计，全球共有真菌150万种以上，而目前仅知其中的4.6%，约7万种，其中大型真菌约有 1万种[2～3]。我国相关研究开展较晚，但在广大真菌学者研究的基础上，也已摸索出一套野外采集及分类研究分析的方法。20世纪40年代开始对大型真菌进行研究，已记载了大型真菌1200属、5000多种[4～6]，我国目前已知的各类大型真菌约3万多种，其中食、药用菌近1000种，已经人工栽培的约100余种[7]。随着分子生物学技术的迅猛发展，真菌分类学已经从表型分型进入了基因分型的新时代，为方便广大真菌爱好者及初学者迅速掌握大型真菌野外采集及研究方法，本文将在中国科学院昆明植物研究所期间所学到的研究方法介绍如下。
2野外采集
2.1采样策略
大型真菌的分布和它们的生长习息相关，例如有些子实体有着朝生暮死的特性，这为研究带来很多不确定性，在一年中的某些时候，采样地点的很多物种并不会结实，因此单次采集所得的结果并不可靠，为了对采样地点的大型真菌生态学特性做出正确的估计，在每年结实期内的多次采集是必不可少的。再例如有些子实体如乳牛肝菌等与针叶树有严格的共生关系，故在采样前可依照中国植物志[8]针叶树的分布进行有针对性的设计路线。中国的大型真菌分布较广，根据南北不同的出菇季节，可每年进行多次出菇采集。
2.2大型真菌野外采集的准备
自制子实体干燥烘箱（包括联创牌PCT取暖器、定制铁板防风罩和网眼托盘）、吸水纸、自封袋、硅胶、装有Buffer 的离心管、酒精灯、镊子、小勺、GPS 定位仪、数码相机、脚架、采集刀、记录笔、记录纸、反光板、遮阳伞、采集篮、记录纸。
2.3野外工作
在野外采集过程中，为了更准确的反映真菌的生境及子实体的新鲜特征，对子实体进行拍照时建议使用脚架固定数码相机，以保证照片的清晰度，光线不足时使用反光板，光线太明亮时使用遮阳伞，拍照时尽量连同生境一同体现，同时还要用采集刀挖出完整的子实体进行拍照，注意动作要轻，不能把菌根或者假菌根挖断以保证子实体基部及菌根的完整性，以方便对其描述和研究的完整性和准确性。另外，菌盖上的附着物如落叶、小虫等也不要弹掉，可判定是否有毒；菌盖上的鳞片、绒毛等应保持完整，盖缘的菌幕残片也要注意保护，作为鉴定的重要依据；菌柄上的绒毛、鳞片等均要保持其完整；腹菌类基部有菌索深入土中，要注意采取；肉质、胶质和蜡质的菌类，保持各部完整[9]。随后用GPS 定位仪定位海拔并记录，同时记录子实体所处的生态环境，如果是共生型真菌要尽可能详尽地记录共生树种，土壤等条件。因为野外采集时间有限，更详细的记录需要回到营地进行补充，另外，建议两人一组，当发现目标，一人进行拍摄，另一人记录信息，以节省时间和精力。最后，将挖出的完整子实体置于不沾的吸水纸中，轻轻包裹好后编号置于采集篮中带回。
当日采集结束后要及时打开吸水纸将菌物取出通风，按照编号在记录纸上对子实体新鲜状态作详细的记录，主要包括：菌盖的形状、大小、颜色，是否粘，有无斑点或疣突，菌盖中部及边缘的特征；菌盖菌肉的厚度、颜色、味道、气味、受伤是否变色；菌褶的形状、大小及着生方式，有无分泌物如乳滴，有无残留菌幕；菌褶与菌柄的连接方式，柄受伤或触摸后颜色的变化，上下部的颜色过渡，是否中空或半中空，柄内菌肉的的颜色，有无腺点及菌环，基部是否膨大或有假根，菌柄的长短粗细等，这些都是极其重要的分类依据，尤其需要注意颜色的变化。同时，还要记录采集地、采集人、采集时间、种名等信息。
记录完成后进行标本的制作，首先将自制子实体干燥烘箱准备好：将铁板防风罩支好，插入网眼托盘，将烘干用的PCT取暖器置于底层，风口向上，围上布帘，但注意留上部通风。用酒精灯灭过菌的镊子从每一号标本上撕取或用小刀切取子实层的一小块，再用裁好的吸水纸包好后置于盛有硅胶干燥剂的2号自封袋中制作成分子材料，或者同样的方法获得一小块置于盛有Buffer的离心管中保存，此两种方法用于进一步的分子系统学研究。剩下的子实体纵向剖开挂上标签（与记录纸上的号必须一致）后置于网眼托盘上，打开热风开关进行烘干，一般为6～8 h，之后通风回潮20 min左右，根据大小装入合适的自封袋中，野外采集任务结束后带回存放于标本馆中作为凭证标本。存放之前为每一份标本制作一个贴有标签的标本袋，标签上需登记标本馆号、标本名称、采集地、采集日期、采集人、采集号及鉴定人等完整信息，并在标本袋中附上标本记录纸的复印件，然后将标本袋整理装箱，用特大号自封袋将箱子连同里面的标本一并密封放入标本馆的冰柜中冷冻两个星期，目的是杀死虫卵，最后从冰柜中取出去掉自封袋放置一天进行回潮，待回潮完毕将标本按照标本馆号存入标本库中永久保存。同时，要在标本馆的登记簿上登记相应的入馆信息。特别注意的是，定学名和颜色时，可以参考《中国的真菌》（ 邓叔群，1963） 、《中国大型真菌》（ 卯晓岚，2000）[7]、《中国大型真菌原色图鉴》（ 黄年来，1998）[10]、《中国药用真菌图鉴》（ 应建浙）[11]、《中国野生大型真菌彩色图鉴》（ 刘旭东）[12]、《Farver I Farver》（Andrea kornerup og Johan Henrik Wanscher）色谱[13]等工具书。
3显微观察
3.1显微观察准备
显微镜（DM-2500 of LEICA in Germany，带显微镜DFC-450C成像绘图管，用于子实体的显微形态观察和绘图）、刀片（上海吉列刀片有限公司“飞鹰牌”S-74 型不锈钢双面刀FC片）、电脑、拍照软件（Leica Application suite V4.3.0）、载玻片、盖玻片、镊子、吸水纸、铅笔。
3.2显微观察用试剂
KOH：将5 g或10 g的氢氧化钾溶解于95 mL或90 mL蒸馏水中至完全溶解，制成5%或10%的氢氧化钾溶液，常温放置，用于干燥的子实体标本的组织恢复，便于显微镜观察。
刚果红：用钝头镊子夹取少许刚果红棕红色粉末溶于盛有蒸馏水的滴瓶中，混匀置于棕色瓶中常温放置（以防止时间长了产生沉淀影响观察），用于子实体组织的染色，便于观察和显微绘图。
蒸馏水：均为蒸馏两次的ddH2O。
3.3显微观察
显微观察是系统分类的关键环节，切片时，左手持干标本，右手握刀片，用手臂的力量带动刀片切取要观察的组织结构，切取的组织尽可能要薄，以方便观察。观察内容主要包括：担子的形状、大小、化学特征；担子小梗的大小；担孢子的形状，大小；侧生囊状体、缘生囊状体和柄生囊状体的有无、形状、大小、是否含有内含物及在KOH溶液和梅试剂中的成色反应；盖表结构和柄表结构；菌髓菌丝等。将切取的待观察组织块放入载玻片上滴有5%或10%KOH溶液的液滴中，赶走组织块中的气泡，浸泡1～2 min使其组织恢复后，盖上盖玻片。然后在载玻片的一端滴一滴刚果红溶液，用吸水纸从另一侧吸引，使组织块染色，或者在盖盖片之前，在有组织块的KOH溶液旁边滴一滴刚果红溶液，用刀尖使其混匀，这样可以使要观察的组织块更为均匀地染色。连接电脑与显微镜，观察时先用10×低倍镜进行观察，然后在10×100 油镜下观察并详细记录各部位的特征，再用Leica Application suite V4.3.0软件分别对盖表皮、菌肉、孢子、担子、囊状体、柄表皮等进行拍照和测量，如果需要手绘图的，可以按比例借助绘图管绘制图像，绘制完成后再用硫酸纸印描一遍，扫描至电脑中，用Adobe photoshop CS3修图后方可在文中使用。具体操作如下。
以切盖表皮为例，如果是完整的子实体，先将子实体沿纵轴剖开，但是为方便烘干，多数情况在野外已将子实体纵向剖为两半，然后在盖缘至中心的1/2 处可将刀片与菌盖表面垂直，沿菌盖径向做切片，尽可能越薄越好，一次可多切几片组织块，或者用镊子在盖表皮上撕取，注意撕取时鳞片和表皮分开撕取。先在5%KOH中观察，然后用刚果红染色后进行绘图或者拍照。根据菌物的不同，可适当延长组织块复水时间，保证观察效果。盖表皮菌丝及一些簇生或丛生的结构一般会比较聚集不方便观察，可以用橡皮或笔轻压临时装片，使其结构散开，方法是按住盖玻片的两个对角，以稳定待观察的组织块，右手用橡皮或笔末端轻敲玻片。由于菌丝长度一般较长无法测得，可进行拍照并测量菌丝的宽度，将比例尺调至10 μm，需要测得一个最粗菌丝的宽度，再测一个最细的宽度，最后测10个均匀大小的菌丝的宽度，算出均值。其他部位的观察类似，可以测量长度的结构需要同时测量长度和宽度。注意担孢子在测量时因随机寻找至少10-20个静止不动的成熟孢子，选取孢子的侧面观（看到孢子的脐突位于孢子顶端，孢子两端都清晰），测量其长和宽并绘图或拍照，注意脐突不在测量范围内，孢子的大小以长乘以宽表示：（a）b-c（d）；Q 表示担孢子的长宽比，Q = a±b，a 表示担孢子长宽比的算术平均值，b 为标准差；＼[n/m/p＼]表示测量了p 份标本的m 个子实体上的n个担孢子。
4分子生物学研究
4.1研究材料及实验准备
研究所用的分子材料主要来自于野外采集时所保留的分子材料及标本馆的标本。所用工具设备有记号笔、研磨棒、离心管、锥形瓶、石英砂、液氮、镊子、酒精灯、移液、头、冰浴盒、微波炉、高压蒸汽灭菌、SCILOGEX离心机、METTLER TOLEDO pl203电子天平、SORVALL离心机、WD-9403C紫外成像仪、TaKaRa PCR热循环仪、DRY BATH干式恒温器、Thermo Gene company limited DNA检测仪。
4.2分子实验用试剂
1mol/LTris-Hcl：将12.11g Tris （三羟甲基氨基甲烷）充分溶解于90 mL ddH2O 中，加入浓盐酸调节pH值至所需值，加ddH2O定容至100 mL，使最终浓度为1 mol/L，1.034×105 Pa 高压蒸汽灭菌15min。
0.5 mol/L EDTA（pH8.0）：将46.5 g EDTA・Na・2H2O（二水乙二胺四乙酸二钠）充分溶解于200 mL ddH2O中，用NaOH 调节溶液的pH 值至8.0，然后用ddH2O定容至250 mL，1.034×105 Pa高压蒸汽灭菌15 min。
50×TAE：将242 g Tris （三羟甲基氨基甲烷）溶于500 mL ddH2O中，加入57.1 mL冰醋酸，100 mL 0.5 mol/L EDTA（pH8.0），然后用ddH2O定容至1000 mL。
4×CTAB 缓冲液： 将100 mL 1 mol/L Tris-HCl，40 mL 0.5 mol/L EDTA（pH8.0），82 g NaCl，40 g CTAB充分溶于800 mLddH2O中，定容至1000 mL，1.034×105 Pa 高压蒸汽灭菌15 min。
去多糖Buffer：将100 mL 1 mol/L Tris-HCl，50 mL 0.5 mol/L EDTA（pH8.0），7.305 g NaCl，充分溶于300 mL ddH2O中，定容至500 mL，1.034×105 Pa 高压蒸汽灭菌15 min，备用。
5 mol/L CH3COOK：将49.1 g KAc（醋酸钾）充分溶解于90 mL ddH2O中，加ddH2O定容至100 mL，1.034×105 Pa 高压蒸汽灭菌15 min。
1 mol/L CaCl2：将11.1 g CaCl2充分溶解于80 mL ddH2O中，定容至100 mL，-20 ℃保存。
50 mg/mL 氨苄青霉素：将5 g氨苄青霉素充分溶解于80 mL ddH2O中，然后加ddH2O定容至100 mL，用孔径为0.22 μm滤器过滤除菌，分装成1 mL小份贮存于-20 ℃。在使用时，每100 mL LB培养基加入贮存液100 μL，使工作浓度为50 μg/mL。
TE 缓冲液：80 mL ddH2O 中加入1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）1 mL 和0.5 mol/LEDTA（pH8.0）200 μL，充分混匀，加ddH2O定容至100 mL，1.034×105 Pa 高压蒸汽灭菌15 min，备用。
1%溴酚蓝（1% bromophenol blue）：1 g溴酚蓝溶于100 g水中。
4.3分子研究方法
4.3.1DNA 的提取（CTAB 法[14]）
获取高质量的总DNA是进行分子生物学研究的前提和基础，大型真菌的细胞壁主要由几丁质和纤维素组成，以几丁质为主，几丁质具有保护作用，使得细胞壁坚实，不易裂解[15]，因此在研磨过程中，需要把样品磨至细粉状，否则会影响DNA产量及质量；但研磨时间不宜过长，样品会因长时间研磨而发生褐变反应，最终也会影响DNA产量及质量，故操作时应尽量在最短时间内迅速把样品研磨成细粉状，以便提高DNA产量和质量[16]，可以利用液氮快速冷冻进行研磨，如果是比较容易研磨的样品或者新鲜的样品也可以不用液氮。下面介绍一种本实验室常用的DNA 提取法。
（1）根据实验需要准备1. 5 mL离心管数个，用记号笔在离心管盖上标记样品号。用灭过菌的镊子夹取适量干燥的分子材料放入离心管中，用移液加入500 μL4×CTAB缓冲液浸泡半小时左右，再加入少量石英砂，用研杵充分研磨，或者先加入200 μL4×CTAB缓冲液和少量石英砂研磨至糊状，再加入300 μL4×CTAB 缓冲液继续研磨液直至材料细腻均匀；也可利用液氮快速冷冻进行研磨；
（2）提前10 min将置于-20 ℃保存DDT取出，常温下融化，每管30 μL加入离心管中，充分混匀；
（3）将离心管放入调至65 ℃的干式恒温器中，放置3 h（老材料5 h），期间不定时轻摇；
（4）取出离心管，在离心管中加入200 μL 3M的CH3COOK溶液，充分混匀，置于冰浴盒中冰浴30 min；
（5）冰浴后取出离心管，加入500ìL氯仿-异戊醇（V∶V=24∶1），轻摇2～3 min，置于离心机中10000 r/min离心10 min，从离心机中轻轻取出离心管，避免剧烈震荡，吸取上清液导入新的离心管中并用记号笔标注对应的号，尽量避免吸到下层沉淀；
（6）在离心管中加入等体积的氯仿-异戊醇（V∶V=24∶1），轻摇2～3 min，置于离心机中10000 r/min离心10 min，从离心机中轻轻取出离心管，吸取上清液弃下清液导入新离心管，注意尽量不要取到下层的沉淀；
（7）向盛有上清液的离心管中加入2/3 体积-20 ℃下预冷的无水乙醇，轻摇，放于-20 ℃的冰箱中，沉降过夜；
（8）第二天从冰箱中取出离心管，置于离心机中10000 r/min 离心10 min，弃上清液，注意动作要轻，防止DNA丢失；
（9）加入200 μL 70%的乙醇洗两次，然后再用无水乙醇洗一次，每次加入酒精洗涤时都要置于离心机中13000 r/min离心2 min，注意弃酒精时避免DNA丢失；
（10）将开口的离心管放于调至37 ℃的烘箱或干式恒温器中约0.5 h，使乙醇彻底挥发，可以闻一下无酒精味证明酒精已挥发；
（11）干燥后，加入200 μL灭过菌的ddH2O溶解DNA，摇匀，制成原液，保温30 min，置于冰箱-4 ℃冷藏备用。
4.3.2DNA含量检测
Acid按钮，进入到测试页面。浸泡于酒精中的酒精棉挤干，擦拭仪器的探头，酒精挥发干后先用移液滴1 μL的ddH2O，盖上盖子，然后单击对话框中的Blank按钮，进行调试，没有问题后可以开始测DNA样品的含量。注意每次测之前都要用酒精棉对探头进行擦拭以免污染，酒精挥发干净后再在探头上滴1 μL 的待测样品，取样前摇匀，每次换头避免污染。测试后得到吸收曲线及DNA含量，做好记录，含量和峰值均达标的进行下一步操作，反之摒弃。
4.3.3PCR（Polymerase Chain Reaction）扩增
（1）PCR原理。在DNA聚合酶的催化下，以特定的DNA为模板和特定的核酸片段即PCR引物为扩增起点和终点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外体系中复制出大量与母链模板中所需的DN段互补的子链DNA的过程。
（2）所需引物。在对大型真菌进行分子系统学研究时，引物的主体通常是一段5’3’的与靶序列严格互补的寡核苷酸短链，根据实验的不同目的，所选取的基因片段不同，一般可以选取ITS、mtLSU、mtSSU、nLSU、1 EF1a 等多基因片段进行筛选和分析。由于ITS的序列分析能实质性地反映出属间、种间以及菌株间的碱基对差异，此外ITS序列片段较小，人们可以从不太长的序列中获得足够的信息，易于分析，目前已被广泛应用于真菌属内不同种间或近似属间的系统发育研究中[17]，并作为主要的分析方法应用于大型真菌研究中。比较常用的ITS通用引物是：ITS1/ITS4；ITSF/ITS4；ITS5/ITS4。
（3）PCR 扩增反应体系。一般选用25 μL体系，包括10×Buffer（withMg2+）2.5 μL，2.5mM dNTPs 2.0 μL，0.1%BSA 2.5 μL，10 μM引物各1.5 μL，5U/μL 的TaqDNA聚合酶0.2 μL，DNA 模板5 μL，最后用ddH2O定容至25 μL。
（4）PCR 扩增反应热循环参数。PCR反应过程实际上是一个温度循环变化的过程，一般包括变性―退火―延伸三个基本反应步骤，其基本步骤如下：94 ℃变性5 min，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，连续35个循环；94 ℃变性1 min，48～53 ℃退火90 s，使寡核苷酸引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；72 ℃延伸2 min，在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链；循环结束后72 ℃延伸10 min，最后4 ℃或12 ℃保存。经过一定数量的循环之后，待扩目的DN段的数量将被扩增放大几百万倍。
4.3.4琼脂糖制胶电泳检测PCR 扩增产物步骤
（1）在电子天平中称量琼脂糖粉0.5 g，倒入锥形瓶中；
（2）量取1×TAEBuffer 50 mL，倒入锥形瓶中，摇匀；
（3）将锥形瓶放入微波炉中，调至解冻档加热2～3 min使琼脂糖粉充分溶解于1×TAE Buffer中；
（4）用棉手套从微波炉中取出锥形瓶，室温冷却至50～60 ℃，避免剧烈震荡产生气泡；
（5）向冷却后的锥形瓶中加入Gold view核酸染料3 μL摇匀，避免产生气泡；
（6）将胶液倒至电泳小槽底托中，在具有黑条带的一侧插入梳子，室温冷却凝固；
（7）凝固后拔出梳子，将底托连同凝胶一同移至电泳槽中；
（8）向电泳槽中加入1×TAE缓冲液直至没过凝胶；
（9）依据需要扩增的DNA样的个数在塑料盒上点1%溴酚蓝各1 μL，再将对照（DNA Marker D 2000）和扩增产物分别取3μL 与溴酚蓝混匀，注意用移液吸取DNA样时需要更换头，避免污染；
（10）混匀后点样于制好的琼脂糖凝胶上，先将DNA Marker 注入到长方形小孔内，再依次按顺序点入待测样，然后在电压梯度4.5～5.5 V下电泳10～20 min；
（11）取出琼脂糖凝胶置于紫外成像仪上观察、照相并记录结果，阳性产物送样测序。
4.3.5产物测序
将PCR 扩增产物或克隆后阳性穿刺管送样测序（上海生工生物工程技术服务有限公司、北京擎科新业生物技术有限公司），测序仪为ABI3730 DNA 测序仪，测序引物分别为PCR 扩增引物和克隆通用引物。
李博，等：中国大型真菌野外采集及分类研究分析方法生物与化工
5序列比对及分子数据分析
测序后，获得多条相关序列，打开Text文本建成“>种名_标本馆号序列”的格式并保存。。从网页搜索Blast （ http： // blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. Cgi BLAST下的Nucleotide Blast选项，弹出新对话框，在Enter Query ； 。 Application，在下拉菜单中单击Clustalw Multiple alignment，在新对话框中的Number of bootstraps中输入100-1000，单击Run clustalw按钮即可，系统会自动排序。但是系统排序的结果还需要进一步进行手动排序，原则是在“Edit”状态下通过删除“D”（Delete gaps with right mouse click）或增加“I”（Insert gaps with right mouse click）选项手动删除或添加空格以达到纵向对齐的效果，还要对照序列图谱人工检查自测序列每一个碱基的准确性，必要时进行简并碱基替换，方法是在原始序列中查看对应的曲线峰图，对照峰图检查碱基是否异常，如果出现错误则回到自己的序列中进行更正。双向获得的序列同Chroma人工核对拼接后再用于比对。核对完成之后，以ITS 序列为例， 。 sequences as选项，在弹出对话框中选择NEXUS，然后保存成NEXUS parsimony：MP）分析。 Likelihood：ML）。除此之外，比较常用的还有贝叶斯分析（Bayesian Analysis），与最大简约性分析相比，贝叶斯分析的优点是所需要的运算时间短，可用于快速构建系统发育树和获得检验概率。
6结语
自然界中真菌种类繁多、形态各异，依靠形态、生化等表型特征来鉴定真菌，既需要丰选项的的鉴定工作经验又需要较长的检验时间，困难较大，尤其是我国有着丰富的植被类群，地理生态环境复杂，故大型真菌种类丰富多样，对于那些生长条件特殊、形态相似的菌株要通过传统的表型特征鉴定方法来加以鉴别显得非常困难，因此，本文结合形态观察、显微观察及分子生物学方法在大型真菌的分子生物学鉴定中的应用作初步的介绍与分析。做好大型真菌的分类，除了对分类学研究具有重要的意义外，还可以更好的服务于人类。例如，大型真菌里很多种类都是美味的野生食用菌，所以很多地区都有采集野生菌食用的传统[18，19]，常见的有香菇、金针菇、平菇、木耳、银耳、羊肚菌等，目前很多种类均已人工驯化成功，并投入生产出现在老百姓日常的餐桌，它们既是一类重要的大型食用真菌，又是食品和工业的重要资源；一些大型真菌能够分解枯死植物，对维持自然界物质循环、生态平衡有重要的作用；此外，很多野生大型真菌都是有毒的，每年全世界都有大型真菌中毒致死事件发生，误食后会出现腹泻、呕吐、精神错乱等症状，严重者会出现肝脏、肾脏受损或心力衰竭而导致死亡，出现误食的原因往往是由于对野生真菌的了解相对缺乏；一些大型真菌能引起树木病害或损害多种木质产品，对此类病原真菌的认识的加强，有利于预防和减少危害的发生。因此，对大型研究的是十分重要的，相关知识的普及也尤为重要。
致谢
感谢导师孙丽华教授的指导和帮助；感谢中国科学院昆明植物所刘培贵教授提供的科研平台；感谢实验室王向华博士在野外采集及科研过程中给予的指导和帮助，感谢时小菲博士前期的工作奠定的基础；感谢实验室的同学们在实验中提供十分有价值的讨论和帮助，值此表示诚挚的敬意和衷心的感谢！
参考文献：
[1]饶俊，李玉.大型真菌的野外调查方法[J].生物学通报， 2012（5）：1～6.
[2]Hawksworth D L. The fungal dimension of biodiversity： magnitude， significance， and conservation[J]. Mycological research， 1991（95）： 1～655.
[3]Kohlmeyer J， Volkmann-Kohlmeyer B. The biodiversity of fungi on Juncus roemerianus[J]. Mycological research， 2001， 105（12）： 1409～1412.
[4]刘培贵，王向华，于富强.中国大型真菌生物多样性的关键类群[J].云南植物研究，2003，25（3）：285～296.
[5]HaRRIngton T J. Relatinonships between macrofungi and vegetation in the burren[J]. Biology and enviroment， 2003， 103 （3）： 147～159.
[6]卯晓岚.中国蕈菌[M].重庆：重庆出版社，2009.
[7]卯晓岚.中国大型真菌[M].郑州：河南科学技术出版社，2000.
；科学出版社，2004.
[9]何炎裕方杰，吴旺宝，等.大型真菌野外实习的探索[J].安徽农业科学，2015，43（7） ：385～386，388.
[10]黄年来.中国大型真菌原色图鉴[M].北京：中国农业出版社，1998.
[11]应建浙，卯晓岚，马启明，等.中国药用真菌图鉴[M].北京：科学出版社，1978.
[12]刘旭东.中国野生大型真菌彩色图鉴[M].北京： 中国林业出版社，2004.
[13]Andrea kornerup， Johan Henrik Wanscher.《Farver I Farver》[M]， politikens forlag K BENHAVN， 1961.
[14]Doyle J J， Doyle J L. A rapid DNA isolation procedure for small qualities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin， 1987（19）： 11～15.
[15]张明，赵呈裕.丝状真菌高分子量DNA的提取研究[J].广西医科大学学报，1998，15（2）： 41～43.
[16]周玲玲，梁俊峰.大型真菌DNA提取方法的改进[J].广东林业科技，2011，27（1）：13～16.
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